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人甘露聚糖結(jié)合凝集素關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶1(MASP1)ELISA試劑盒
簡介
甘露結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶1又稱甘露糖相關(guān)絲氨酸蛋白酶1（MASP-1），是一種在由MASP1基因編碼的酶，MASP-1參與補體系統(tǒng)的凝集素途徑，負責(zé)將C4和C2裂解成片段，形成C3轉(zhuǎn)化酶，MASP-1是一種絲氨酸蛋白酶，作為補體激活的凝集素途徑的一個組成部分發(fā)揮作用，補體途徑在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起著重要作用，MASP-1以酶原形式合成，當(dāng)它與凝集素途徑的病原體識別分子、甘露糖結(jié)合凝集素和菲考林復(fù)合時被激活，該蛋白不直接參與補體激活，但可能通過裂解補體C2或激活另一種補體絲氨酸蛋白酶MASP-2而發(fā)揮補體激活的放大器的作用。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物MASP1，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中MASP1的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從120ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至6000pg/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的6000pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將6000pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 6000pg/mL、 3000pg/mL、 1500pg/mL、 750pg/mL、 375pg/mL、 187.5pg/mL、 93.75pg/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)。
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從120ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至6000pg/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的6000pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將6000pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 6000pg/mL、 3000pg/mL、 1500pg/mL、 750pg/mL、 375pg/mL、 187.5pg/mL、 93.75pg/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如待測樣本中MASP1濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。
下圖所示標準曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結(jié)果
重復(fù)性
結(jié)果的計算
計算標準品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。
|
標準品濃度(pg/mL) |
6000 |
3000 |
1500 |
750 |
375 |
187.5 |
93.75 |
0 |
|
OD值 |
2.470 |
1.754 |
1.051 |
0.682 |
0.392 |
0.248 |
0.172 |
0.052 |
|
2.418 |
1.702 |
0.999 |
0.63 |
0.34 |
0.196 |
0.12 |
0 |
下圖所示標準曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結(jié)果
重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為46.88pg/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組人MASP1。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。
使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。
